多肽合成技术

多肽化学合成的基本介绍

多肽化学合成方法,包括液相和固相两种方法。液相合成方法现在主要采用BOC和Z两种保护方法,现在主要应用在短肽合成,如阿斯巴甜,力肽,催产素等,其相对与固相合成,具有保护基选择多,成本低廉,合成规模容易放大的许多优点。与固相合成比较,液相合成主要缺点是,合成范围小,一般都集中在10个氨基酸以内的多肽合成,还有合成中需要对中间体进行提纯,时间长,工作量大。固相合成方法现在主要采用FMOC和BOC两种方法,它具有合成方便,迅速,容易实现自动化,而且可以比较容易的合成到30个氨基酸左右多肽。
1.1.氨基酸保护基
20种常见氨基酸,根据侧链可以分为几类:脂肪族氨基酸(Ala,Gly,Val,Leu,Ile,),芳香族氨基酸(Phe,Tyr,Trp,His),酰胺或羧基侧链氨基酸(Asp,Glu,Asn,Gln),碱性侧链氨基酸(Lys,Arg),含硫氨基酸(Cys,Met),含醇氨基酸(Ser,Thr),亚氨型基酸(Pro)。多肽化学合成中氨基酸的保护非常关键,直接决定了合成能够成功的关键。因为常见的20中氨基酸中有很多都是带有活性侧链的,需要进行保护,一般要求,这些保护基在合成过程中稳定,无副反应,合成结束后可以完全定量的脱除。合成中需要进行保护的氨基酸包括:Cys,Asp,Glu,His,Lys,Asn,Gln,Arg,Ser,Thr,Trp,Tyr。需要进行保护的基团:羟基,羧基,巯基,氨基,酰胺基,胍基,吲哚,咪唑等。其中Trp也可以不保护,因为吲哚性质比较稳定。当然在特殊的情况下,有些氨基酸也可以不保护,象,Asn,Gln ,Thr,Tyr。
表1 常见3种氨基脱除条件

 

TFA

HBr/TFA

H2/Pd-C

Piperidine/DMF

Boc

y

y

n

n

Z

n

y

y

n

Fmoc

n

y

n

y


图1 常见3种氨基保护基结构
氨基酸侧链保护基团非常多,同一个侧链有多种不同的保护基,可以在不同的条件下选择性的脱除,这点在环肽以及多肽修饰上具有很重要的意义。而且侧链保护基和选择的合成方法有密切的关系,液相和固相不一样,固相中BOC和FMOC策略也不一样,从某种意义上看,多肽化学就是氨基酸保护基的灵活运用与搭配。关于侧链保护基的使用,请参考王德心的《固相有机合成——原理及应用指南》第四章,我们这里主要介绍Cys,Lys,Asp的几种保护基及其脱除方法。Cys最常见的保护基有三种,Trt,Acm,Mob,这三个保护基可以完成多对二硫键多肽的合成。Lys最常见的保护基有:Boc,Fmoc,Trt,Dde,Allyl,这对于固相合成环肽提供了很多正交的保护策略。Asp最常见的保护基有:Otbu,OBzl,OMe,OAll,OFm,同样也提供了多种正交的保护策略。
表2 巯基常见保护基


简称

结构

脱除条件

Trt

TFA,HCl/HOAc,I2/MeOH

Acm

I2/MeOH,Hg2+

Mob

HF,TFMSA,Hg2+

表3 氨基常见保护基


简称

结构

脱除条件

Trt

TFA,HOAc,HCOOH

Boc

HCl/HOAc,TFA/DCM

Fmoc

Pip/DMF,NaOH/MeOH

Dde

H2NNH2/DMF

Allyl

Pd(Ph3P)4,吗啉/THF

表3 羧基常见保护基


简称

结构

脱除条件

Otbu

TFA,HOAc,HCOOH

OBzl

H2/Pd,HF,TFMSA

OMe

NaOH/MeOH

OAll

Pd(Ph3P)4,吗啉/THF

OFm

Pip/DMF,DBU/DMF

1.2.多肽缩合试剂
目前多肽合成中,主要采用羧基活化方法来完成接肽反应,最早使用的是将氨基酸活化为酰氯,叠氮,对称酸酐以及混合酸酐的方法,但是由于这些条件下,存在氨基酸消旋,以及反应试剂危险以及制备比较复杂,逐渐被后来的缩合试剂取代,按照其结构可以分为两种:缩合试剂主要有:碳二亚胺型,鎓盐型(Uronium)。
1.2.1.碳二亚胺型
主要包括:DCC,DIC,EDC.HCl等。采用DCC进行反应,由于反应中生成的DCU,在DMF中溶解度很小,产生白色沉淀,所以一般不用在固相合成中,但是由于其价格便宜,在液相合成中,可以通过过滤除去,应用仍然相当广泛。EDC.HCl因为其水溶解性的特点,在多肽与蛋白的连接中使用比较多,而且也相当成功。但是该类型的缩合试剂的一个最大的缺点,就是如果单独使用,会有比较多的副反应,但是研究表明如果在活化过程中添加HOBt,HOAt等试剂,可以将其副反应控制在很低的范围。其反应机理如下:

图2  DIC活化反应机理
1.2.2.鎓盐型
鎓盐型缩合试剂反应活性高,速度快,现在使用非常广泛,主要包括:HBTU,TBTU,HATU,PyBOP等。该试剂使用过程中需要添加有机碱,如,二异丙基乙胺(DIEA),N-甲基吗啉(NMM),该试剂加入后,才能活化氨基酸。其反应机理如下:

图3  TBTU活化反应机理
1.3.多肽合成方法比较
1.3.1.液相多肽合成(solution phase synthesis)
液相多肽合成现在仍然广泛的使用,在合成短肽和多肽片段上具有合成规模大,合成成本低的显著优点,而且由于是在均相中进行反应,可以选择的反应条件更加丰富,象一些催化氢化,碱性水解等条件,都可以使用,这在固相中,使用却由于反应效率低,以及副反应等原因,无法应用。液相多肽合成中主要采用BOC和Z两种反应策略。

图4液相合成Glu-Trp
1.3.2.固相多肽合成

图5  FMOC固相合成Glu-Trp
固相多肽合成现在使用的主要有两种策略:BOC和FMOC两种。BOC方法合成过程中,需要反复使用TFA脱BOC,而且在最后从树脂上切割下来需要使用HF,由于HF必须使用专门的仪器进行操作,而且切割过程中容易产生副反应,因此现在使用受到实验条件限制,使用也逐渐减少。FMOC方法反应条件温和,在一般的实验条件下就可以进行合成,因此,也得到了非常广泛的应用。
1.3.2.1.固相合成中常用树脂
固相合成中树脂,一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料,大小在75-150μm,交联度在1-2%之间,现在使用的大多是1%,因为这种交联度下,树脂在DMF,DCM中具有很好的溶胀性能,立体上是一个空间网状结构,反应物分子可以在树脂内部自由移动。树脂中最关键的部分是连接手臂,它一端连接在树脂上,一端作为反应位点。目前广泛使用的树脂有:PAM,MBHA,Wang,2-Cl-Trt,Rink-Amide-MBHA等。其中PAM,MBHA是用在BOC策略中,因为其对酸非常稳定,需要在HF,TFMSA等强酸条件下才能够切割下来。

图6  固相合成常用树脂
1.3.2.2.茚三酮检测
固相多肽合成中,主要是通过检测树脂上游离氨基来判断连接效率,检测方法称为Kaiser方法,其检测结果,如果有游离氨基的时候,显示兰色,或红褐色(pro,ser,His)。
Kaiser试剂包括:
A,6% 茚三酮的乙醇溶液
B,80% 苯酚的乙醇溶液
C,2% 0.001M KCN的吡啶溶液
配制中的吡啶需要经过茚三酮处理后,重蒸后再使用。检测过程,取少量树脂,加入A,B,C各2-3滴,100℃下加热1-2min,如果溶液有兰色,或树脂出现兰色,红褐色,表明还有游离氨基,否则说明连接完全。
还有其它检测游离氨基的方法:三硝基苯磺酸法,苦味酸法,溴芬兰法等。

图7 茚三酮检测原理
1.3.2.3.固相合成切割方法
固相合成完成之后,必须选择合适的切割试剂将多肽从树脂上切割下来,然后经过冰乙醚沉淀,离心收集沉淀,经过HPLC分离纯化,冷冻干燥得到最后产品。由于选择的树脂不同,氨基酸序列不同,在切割时候,选择的切割方法也不完全相同,一般都是选择酸性条件下切割的条件,对于PAM,MBHA树脂,一般采用HF切割,切割过程中需要添加对甲苯酚,对巯基苯酚,苯甲醚等试剂。而对于Wang,Rink-Amide,Trt树脂,一般采用TFA切割,切割过程中加入,乙二硫醇,苯甲硫醚,水,三异丙基硅烷,苯酚等。这些添加试剂主要作为碳正离子俘获试剂使用,目的是俘获切割反应过程中生成的碳正离子,减少这些碳正离子对部分氨基酸侧链的进攻导致的副反应,比较容易产生副反应的氨基酸有:Trp,Tyr。切割试剂用量一般10-15ml/g树脂。常用的切割配比:HF/p-cresol/p-thiocresol(90/5/5),TFA/TIS/EDT/H2O(94/1/2.5/2.5),反应一般是在室温条件下2h-4h。
1.3.3.多肽合成中主要问题
1.3.3.1.消旋及其反应机理
多肽合成过程中,部分氨基酸在活化的过程中会导致不同程度的消旋,特别容易消旋的氨基酸有:Cys,His,Phe,当然这些消旋化还和溶剂,温度以及合成中的有机碱等因素有关。对于这些氨基酸,可以通过采用高效缩合试剂,减少反应时间,可以减少消旋的比例,一般条件选择适当,消旋化都可以控制在5%以内。消旋反应机理如下:

图8 消旋反应机理
1.3.3.2.二酮哌嗪(DKP)反应
DKP副反应出现在FMOC-Wang树脂合成过程中,主要出现在第一个氨基酸为Pro的时候,当第二个氨基酸脱FMOC的时候,α-氨基被游离出来之后,立即对Wang树脂的苄酯键进行分子内胺解,生成六元环二酮哌嗪衍生物,同时从Wang树脂上释放出来,导致反应终止。该反应非常迅速,文献报道采用50%Pip/DMF,脱1min,4min的条件,但是我们实验证明在多数情况下,即使是1min左右反应就超过了20%。因此一般在末端第一个氨基酸为Pro的时候,建议采用2-Cl-Trt树脂合成,由于该树脂巨大的空间阻力,可以完全消除该副反应。这个副反应在BOC策略合成过程中,却可以完全避免,因为BOC在使用TFA脱除后,使氨基以TFA盐的形式存在,从而失去了亲核性,不能进攻苄酯键。

图9  DKP反应机理
1.3.3.3.困难序列多肽合成
固相多肽合成中也经常遇到多肽合成失败或合成效率很低的问题,这里面的主要原因是由于多肽序列引起的,因为有些多肽序列在树脂上形成β-折叠,改变了树脂的溶胀性能,还有可能将反应的活性位点埋藏在树脂里面,这样使得反应很难进行,目前报道使用的主要方法有:

  • 使用混合溶剂,DMSO/DMF,6N 胍啶/DMF溶液
  • 提高反应温度,或采用微波方法
  • 使用高离液盐,LiCl,NaClO4等。
  • 使用溶胀性能更好的PEG-PS树脂,同时减少树脂担载量(0.05-0.2mmol/g)

1.4.合成多肽分析鉴定方法
多肽的分析鉴定方法有多肽一级结构,二级结构鉴定,多肽一级结构包括:质谱分析,氨基酸组成分析,氨基酸序列分析。二级结构包括:圆二色谱(CD),NMR,X-衍射等方法。
1.4.1.纯度分析
多肽的纯度分析,一般都采用HPLC进行分析,选择RP-C18,粒径5μm,孔径300A,4.6×150mm,流动相:A,0.1% TFA/H2O;B,0.1% TFA/ACN,洗脱梯度,5%B--65%B,时间30min。也有些多肽,特别是短肽,由于亲水性强,在C18上保留很弱,需要改变条件,这里主要有两种方法:一个改变分析梯度,可以将起始梯度改为2%,等度或小梯度洗脱;另外一个方法是在流动相中加入强离子对试剂,如七氟丁酸,十八烷基磺酸钠等。
1.4.2.一级结构分析
1.4.2.1.质谱分析
质谱分析的目的主要是确证分子量,当然采用MS/MS可以部分的了解多肽序列的信息,但是这个需要比较全的数据库作为基础,分析才能比较准确。由于多肽性质不稳定,需要采用软电离技术,目前多肽分析主要使用了电喷雾(ESI-MS),基质辅助激光解吸(MALDI-MS)。其中ESI-MS通常会给出多电荷峰,电荷数目和多肽序列上氨基,胍基,咪唑基的数目有关,因此,经常给出了双电荷,三电荷等离子峰。MALDI-MS可以分析蛋白大分子,而且通常情况下很少带多电荷,因此数据直接对应了分子离子峰,容易分析。此外,通常在分析长肽或蛋白过程中,需要添加NH4,Na,K等离子,提高灵敏度,所以一般在MS中出现一组峰,分别对应:(M+H)+,(M+NH4)+,(M+Na)+,(M+K)+。
1.4.2.2.氨基酸组成分析
氨基酸组成分析一般需要产品的纯度较高,它可以给出多肽中氨基酸的种类,数目。分析过程首先通过酸水解破坏肽键,典型酸水解的条件是:真空条件下,110℃,用6M盐酸水解16至72小时。酸水解虽然很有用,但酸水解条件下不能获得完整的氨基酸分析,因为天冬酰胺和谷氨酰胺的侧链含有酰胺键,用于切断蛋白质肽键的酸也可以将天冬酰胺转换为天冬氨酸,谷氨酰胺转换为谷氨酸。由于水解温度比较高,色氨酸的吲哚环容易被空气氧化,即使在密封的管中,色氨酸的吲哚环也几乎都被破坏了。因此蛋白质的色氨酸含量往往是通过它的紫外吸收光谱估计的,也可以通过碱水解分析色氨酸的含量。半胱氨酸在酸水解中也不能精确测定,要精确测量需要在蛋白质水解之前进行氧化或羧甲基化,形成的衍生物在酸水解之后才能定量。
1.4.2.3.氨基酸序列分析
氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解,主要涉及耦联、水解、萃取和转换等4个过程。首先使用苯异硫氰酸酯(PITC)在pH9.0的碱性条件下对蛋白质或多肽进行处理,PITC与肽链的N-端的氨基酸残基反应,形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物,即PTC-肽。然后PTC-肽用三氟乙酸处理,N-端氨基酸残基肽键被有选择地切断,释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下来将该衍生物用有机溶剂(例如氯丁烷)从反应液中萃取出来,而去掉了一个N-端氨基酸残基的肽仍留在溶液中。萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定,经酸作用,再进一步环化,形成一个稳定的苯乙内酰硫脲(PTH)衍生物,即PTH-氨基酸。留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再重复进行上述反应过程,整个测序过程现在都是通过测序仪自动进行。
1.4.3.二级结构分析
1.4.3.1.圆二色谱(CD)
圆二色谱是一种特殊的吸收谱,它通过测量蛋白质等生物大分子的圆二色光谱,从而得到生物大分子的二级结构,简单、快捷,广泛应用在蛋白质折叠,蛋白质构象研究,酶动力学等领域。圆二色谱紫外区段(190-240nm),主要生色团是肽链,这一波长范围的CD谱包含了生物大分子主链构象的信息。α-螺旋构象的CD谱在222nm、208nm处呈负峰,在190nm附近有一正峰。β-折叠构象的CD谱,在217-218nm处有一负峰,在195-198nm处有一强的正峰。无规则卷曲构象的CD谱在198nm附近有一负峰,在220nm附近有一小而宽的正峰。
1.4.3.2.核磁共振(NMR)
随着二维、三维以及四维NMR的应用,分子生物学、计算机处理技术的发展,使NMR逐渐成为大分子结构物质分析的主要方法之一。NMR可用于确定氨基酸序列、分布以及构象。目前,NMR在分析分子中含少于30个氨基酸的小肽时是非常有用的,分析结果快速准确。
1.4.3.3.X-衍射
X-衍射可获得有关化合物晶型的直接信息,而且可以判断相对与绝对构型。

  • 多肽标记及修饰

目前多肽标记及修饰的内容非常多,广泛应用在多肽药物,多肽生物学,多肽抗体以及多肽试剂的研究中。目前应用广泛的有:非放射性核素标记(C13,H2),荧光标记(FAM,FITC),生物素标记,磷酸化修饰等。
2.1.非放射性核素标记
目前在非放射性核素标记中,使用广泛的仍然是C13,H2,因为其使用安全,放射性小。现在有比较完全的非放射性标记的氨基酸,可以按照正常的多肽合成方法将标记好的氨基酸直接连接到多肽上。
2.2.荧光标记
荧光标记由于没有放射性,实验操作简单。因此,目前在生物学研究中荧光标记应用非常广泛,荧光标记方法与荧光试剂的结构有关系,对于有游离羧基的采用的方法与接肽反应相同,也采用HBTU/HOBt/DIEA方法连接。但是对于FITC标记,需要在连接FITC前,增加一个氨基己酸,避免在切割的过程中被TFA切割掉。
2.3.生物素标记
生物素-亲合素系统 (biotin-avidin system,BAS),是70年代后期应用于免疫学,并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应,并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合,使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。主要有用于标记多肽氨基的生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)和生物素对硝基酚酯(pBNP),其中以BNHS最常用,当然,也可以直接使用生物素也可以标记,因为其结构上有个游离的羧基,采用HBTU/HOBt/DIEA方法缩合,由于生物素的溶解度低,使用DMSO/DMF的混合溶剂增加溶解度。
2.4.磷酸肽合成
磷酸肽在生命过程中发挥重要作用,磷酸化的位置在多肽上的Ser,Thr,Tyr。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸,目前使用的都是单苄基磷酸化氨基酸,Tyr也可以直接使用磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的连接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法,但是目前采用该方法合成磷酸化也有缺点,特别是在合成多磷酸化多肽或长肽的时候,连接效率低,最后产品纯度很低,对于这种磷酸化多肽,我们考虑采用后磷酸化方法,其合成过程就是在多肽合成结束后,选择性脱去要标记的氨基酸的侧链保护基,对于Tyr,Thr可以直接使用侧链不保护的氨基酸进行反应,而Ser可以采用Fmoc-Ser(trt),在1% TFA/DCM条件下可以定量的脱除。后磷酸化,采用双苄基亚磷酰胺,四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体,连接到羟基上,随后在过氧酸下氧化生成磷酰基,完成反应。

  • 蛋白结构与功能模拟多肽

多肽在与蛋白受体结合发挥功能的时候,总是先折叠出某些特殊的结构,多肽类似物合成主要是为了模拟这些结构,保持或提高生物活性,同时也为了改变多肽的稳定性,提高其抗酶解能力。
3.1.α-螺旋多肽
α-螺旋是蛋白结构中最为普通的一种,但是一般多肽在溶液中大多是无规卷曲的,目前使用最多的方法是多肽保持α-螺旋结构就是在多肽表面通过共价键将处在α-螺旋结构的两个氨基酸连接起来,选择的位点(i,i+4或i,i+7),选择的化学键包括:二硫键,硫醚键,酰胺键,烯烃键(RCM)等方法。
3.1.1.二硫键
二硫键广泛存在与蛋白结构中,对稳定蛋白结构具有非常重要的意义,二硫键一般是通过序列中的2个Cys的巯基,经氧化形成。形成二硫键的方法很多:空气氧化法,DMSO氧化法,过氧化氢氧化法等。二硫键的合成过程,可以通过Ellman检测以及HPLC检测方法对其反应进程进行监测。
3.1.2.硫醚键
硫醚键的形成可以通过序列中的Lys,将溴乙酸连接到Lys的侧链氨基上,利用其和巯基的特异性反应,反应在缓冲溶液中进行,迅速高效。
3.1.3.酰胺键
多肽的内酰胺环肽的合成一般是利用Lys,Asp(Glu)的选择性保护,在固相上直接环化。BOC策略中可以采用BOC-Lys(Fmoc),BOC-Asp(OFm),FMOC策略中可以采用FMOC-Lys(Aloc),FMOC-Asp(Allyl)。对于首尾环肽,还可以先合成保护的多肽,然后在液相中环化生成目标多肽。
3.1.4.烯烃键(RCM)
RCM反应是一个过渡金属催化反应,其反应中使用催化剂:(Cy3P)2Cl2Ru=CHPh,可以催化烯烃环化,过程中脱去一分子乙烯。

图10  固相RCM反应
该反应也可以在固相树脂上直接环化,反应条件:15-25% (Cy3P)2Cl2Ru=CHPh DCM,60-80℃,24-48h。
3.2.TASP(template-assembled synthetic peptide)多肽
瑞士Basel大学的化学家首次提出TASP的概念,他们利用具有“发夹”结构的肽链作为模板,然后将具有α-螺旋结构的多肽直接连接到模板上,模拟蛋白质的高级结构。
3.3.长肽或蛋白合成
3.3.1.FMOC-tbu片段缩合方法
FMOC-tbu片段缩合方法在合成长肽以及蛋白上面运用非常广泛,其合成过程首先是合成保护性肽片段,经过纯化后,将几个片段在液相或固相上组装起来。使用本方法主要注意几个方面:片段的选择,片段的合成与纯化,片段缩合方法。片段选择要考虑到片段连接反应时间长,容易导致消旋,故片段的C末端最好选择Gly,Pro。合成的片段一般需要经过C4,C8等纯化,对于溶解性很差的多肽,可以采用硅胶柱层析方法进行纯化。由于片段的分子大,在树脂内移动速度慢,故反应时间一般都很长,而且反应过程中与片段浓度关系很大,溶解的时候,尽量提高片段的浓度。对多种条件的选择,发现采用DMF为溶剂,DIC/HOBt的方法缩合效率最高,消旋也最小。

图11 FMOC-tbu片段缩合示意图
3.3.2.自然化学连接(Native Chemical Ligation)
自然化学连接方法的优点是可以采用完全脱保护的多肽,因此不存在溶解性问题,其反应也是在缓冲水溶液中进行,由于其利用的是巯基和硫酯的特异性反应,再经过由S到N的转变完成肽键的合成。

图13自然化学连接
总之,今后多肽化学的研究,不仅是将更多的有机化学合成新方法,新技术引入到多肽研究当中,而且对蛋白的结构以及功能模拟,开展结构活性研究(structure activity relationship)将是研究开发的热点,因为这将为揭示蛋白的内在的生物活性本质提供大量实验数据。

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